动物实验培训
以SD大鼠脑梗模型为例
01 动物模型制备
- 麻醉大鼠,游离颈总动脉(CCA)和迷走神经,直至 CCA分叉处。钝性分离向内行走的颈外动脉(ECA)及向外后行走的颈内动脉(ICA)
- 分别在CCA和ECA下方穿线,结扎CCA、颈外动脉近分叉部
- 在CCA上距其末端约5.0mm处剪一小口,将线栓沿ICA方向连续轻柔推进,缝合线固定线栓,全层缝合切口
02 石蜡切片制备
- 取材与固定:取出目标组织,将其放入4%多聚甲醛中,固定时间12-24h
- 修整与冲洗:按需修正组织块,放入包埋盒中冲洗4-5h
- 脱水+透明+浸蜡:按75%~无水乙醇梯度酒精中脱水,各1.5h;二甲苯透明10min*2;组织浸蜡
- 包埋:将组织放入金属框中,倒入热蜡,待蜡块完全凝固后取出
- 切片:将蜡块放入-20℃ 5min,增加硬度;将蜡块固定于切片机上,左手执毛笔,右手转动切片机,切出连续切片,厚度为4-6μm
- 展片和捞片:用镊子夹起切片一角平铺在温水中,用黏附载玻片垂直插入水中,靠近切片,轻轻带出,标记信息放在玻片架上
- 烤片:将玻片放在60℃恒温烘箱中1h,易脱片的组织可37℃过夜
03 组织HE染色
- 染色(通过染色区分细胞核和细胞质)
- 脱蜡与复水:依次浸入二甲苯和梯度乙醇,最后置于蒸馏水中
- 苏木素染色:碱性染料,结合细胞核的核酸,通常5-10min
- 返蓝:在自来水中冲洗10min
- 伊红染色:酸性染料,结合细胞质的蛋白质,通常1-3min
- 脱水与透明:梯度乙醇到二甲苯
- 封片&显微镜观察(便于长期保存&观察分析组织结构和病理变化)
- 在切片上滴加中性树脂,避免产生气泡
- 细胞核--蓝色
- 细胞质--和间质-粉色
04 免疫组织化学
- 抗原-抗体特异性结合:抗体选择性地识别并结合组织或细胞中的目标抗原,这是实验的基础
- 显色标记技术:通过酶(如辣根过氧化物酶)、荧光素、金属离子等标记抗体,经化学反应(如DAB显色)使结合位点可视化
- 定位分析功能:可在显微镜下精确定位抗原在细胞或组织中的分布
05 免疫荧光
免疫荧光实验的核心机制是抗原-抗体特异性结合的生物化学反应。实验中采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,与待测样本中的目标抗原(或抗体)结合,形成荧光标记的抗原-抗体复合物。通过荧光显微镜观测激发光下的荧光信号,即可实现目标分子在细胞或组织中的精确定位和定量分析
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