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细胞培养及生理实验培训

细胞培养是现代生物医学研究中的基础技术，掌握正确的细胞培养方法对于实验的成功至关重要。

细胞复苏

在进行细胞复苏前，需要查阅说明书或相关文献，了解：

• 细胞的形态（表皮样、成纤维样或圆形）
• 细胞的生长特性（贴壁或悬浮）
• 细胞所需完全培养基（DMEM、RPMI-1640、DMEM/F-12等）

1. 培养基选择：复苏用培养基需为该细胞最适培养用培养基（推荐查找网站ATCC或Procell）
2. 及时复苏：收到细胞后最好尽快复苏，如要继续保存务必在液氮中保存。如在-70℃下，细胞的存活率将大大降低，甚至死亡。
3. 快速融化：从液氮中取出冻存管，旋紧管盖，迅速置于37℃的水浴中不断摇晃，务必使冻存液在1分钟内融化。
4. 稀释保护：将融化后的冻存液加入到10倍体积的新鲜培养液中，以稀释DMSO的浓度，避免细胞中毒。
5. 温和处理：为将对细胞的伤害降低，亦可不离心直接将有冻存液的细胞接入培养瓶中，贴壁后更换培养基。

细胞传代

传代前需要明确细胞的基本特性：

• 细胞的形态特征
• 生长特性（贴壁或悬浮）
• 所需完全培养基类型
• 细胞传代比例

1. 传代时机：细胞融合到80%就应传代。
2. 接种密度：细胞接种数为5×10⁴~8×10⁵个/ml，传代密度太低时，细胞容易死亡。
3. 胰酶消化：胰酶消化要时刻观察，通过显微镜观察细胞状态避免胰酶消化过度。
4. 细胞收集：细胞离心时尽量在1000 r/min离心5 min，离心转速过大时间过长会对细胞造成很大伤害。
5. 防污染措施：操作前做好灭菌工作，整个操作过程尽量靠近酒精灯。

细胞冻存

1. 冻存设备：使用梯度冻存盒，梯度冻存盒需提前拿至室温中复温。
2. 快速操作：DMSO对细胞有害，因此冻存和复苏操作要尽可能快。
3. 冻存液保存：配置好的冻存液在4℃冰箱内可以暂存1周，在-20℃冰箱内可以保存一个月。不过最好还是现配现用、不要反复冻融。
4. 培养基一致性：复苏时使用的培养基最好与冻存前使用的培养基一致。

细胞生理实验培训

细胞生理实验是研究细胞功能和药物作用机制的重要手段，主要包括细胞增殖、迁移等检测方法。

CCK-8检测细胞增殖

1. 细胞接种：通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行培养并给予0-10微升特定的药物刺激。
2. 试剂添加：每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200微升，则需加入20微升CCK-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
3. 孵育检测：在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

Transwell检测细胞迁移

1. 实验准备：不同细胞侵袭能力不一样，迁移能力和时间也会有不同，可查阅文献确定迁移时间及接种量。
2. 避免气泡：避免下层培养液和小室间气泡产生，影响迁移能力。
3. 膜完整性检查：在实验开始前，检查Transwell膜的完整性，确保没有破损或漏洞；加入细胞时注意不要戳破膜。

EdU检测细胞增殖

1. 细胞铺板：将生长状况良好汇合度达到80%左右的细胞，去除培养基、PBS清洗、胰酶消化制备成单细胞悬液，血球计数板计数，以3×10⁴ cells/500 μL每孔接种于24孔板，接种5孔；于37℃、5% CO₂培养箱培养过夜，用于后续EdU法检测不同处理组细胞增殖状态。
2. EdU检测：根据试剂盒说明书进行实验。
3. 结果分析：荧光显微镜选择不同的视野拍照（一般选择3-5个视野），分别统计同一个视野内阳性细胞数和细胞总数，计算增值率做成统计图。