实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是一种细胞分子生物学上的技术,它在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,通过实时监测反应中荧光信号的积累,来实现对PCR反应的实时监测和定量。这种技术主要应用于多样的细胞分析,如基因表达分析、片段分析、突变分析等。qPCR检测通常使用的方法包括染料法和TaqMan探针法,能够定量或定性的确定各个样本的本底表达量。
技术原理
实时荧光定量PCR(qPCR)技术是一项具有创新思维的细胞分子生物学技术,它通过在PCR反应体系中引入与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号的实时积累来监测整个PCR反应过程。最终,通过相对定量或绝对定量的方法,我们可以确定不同样本的基因表达水平或其他分子指标。qPCR检测中,常用的两种方法是染料法和TaqMan探针法。 TaqMan探针法的核心是探针分子,它通常是一条单链DNA。探针分子的5'端连接着发光基团,而3'端连接着淬灭基团。当探针分子完整而未被水解时,我们无法检测到发光基团发出的荧光信号,因为淬灭基团会吸收荧光并将其熄灭。当PCR反应开始时,模板链会经历热变性解链,形成单链,TaqMan探针优先与模板链退火,然后引物会随后退火到模板上,随后PCR反应会进行链延伸。在延伸的过程中,Taq酶会发挥5'-3'外切酶活性,遇到探针时,会逐个碱基切除探针,从而使发光基团与淬灭基团分离,此时荧光检测系统就可以接收到荧光信号。每当一条DNA链被扩增,就会有一个荧光分子形成,荧光信号的积累与PCR产物的形成是同步进行的。 TaqMan探针法的特异性不仅由引物提供,还由探针分子保证。由于TaqMan探针的退火温度较高,因此该方法具有更好的特异性。在一个反应体系中加入多条探针,可以同时检测多个基因。
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